胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。

胚胎工程（embryo engineering）的许多技术，实际是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。因此，了解哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律，就显得十分重要了。

精子的发生

哺乳动物精子的发生（spermatogenesis）是在睾丸内完成的。雄性动物从初情期（相当于人的青春期）开始，直到生殖机能衰退，在睾丸的曲细精管内不断进行着生殖细胞的增殖，源源不断地产生精子。

各种家畜精子发生的过程大体可以分为三个阶段。

第一阶段，位于曲细精管管壁的精原细胞进行数次有丝分裂，产生大量的精原细胞，其中部分精原细胞经过染色体复制和其他物质的合成，进一步形成初级精母细胞。

第二阶段，初级精母细胞连续进行两次分裂（即减数分裂，包括MI和MII）：第一次分裂产生两个次级精母细胞，每个次级精母细胞再分裂一次产生两个含单倍染色体的精子细胞。

第三阶段，圆形的精子细胞经过变形，其中的细胞核变为精子头的主要部分，髙尔基体发育为头部的顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体聚集在尾的基部形成线粒体鞘。同时，细胞内的其他物质浓缩为球状，叫做原生质滴，随精子的成熟过程向后移动，直到最后脱落。对于多数家畜来说，精子在睾丸内形成的时间为两个月左右。

哺乳动物成熟的精子外形似蝌蚪，分头、颈和尾三大部分。不同种动物精子的形态相似，大小略有不同，与动物的体型大小无关。例如，大鼠的精子190 μm长，而大象的精子却只有50 μm长。

卵子的发生

卵子的发生（oogenesis）是在雌性动物的卵巢内完成的。动物的胚胎在性别分化以后，雌性胎儿卵巢内的卵原细胞，就通过有丝分裂的方式不断增加其数量，并进一步演变为初级卵母细胞，这时，它被卵泡细胞包围，形成卵泡。初级卵母细胞需经过减数分裂才能变为成熟的卵子。减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后完成的，其结果产生一个次级卵母细胞和第一极体，进人输卵管，准备与精子受精。减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程中完成的，次级卵母细胞经分裂产生一个成熟的卵子和第二极体。当在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志。

哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前（即胎儿时期）完成的，这是精子和卵子在发生上的重要区别。

受精

受精（fertilization）是精子与卵子结合形成合子（即受精卵）的过程。它包括受精前的准备阶段和受精阶段。在自然条件下，受精是在雌性的输卵管内完成的。

准备阶段1——精子获能

生殖生物学家张明觉早年进行过兔的体外受精研究。他曾用各种方法处理取自附睾的精子，但都无法使这些精子与卵子在体外受精。这是什么原因呢？后来他发现在多种动物中，进人雌性动物生殖道的精子虽然运行的时间不长，但必须经过这一时段才能与排出的卵子受精。也就是说，刚刚排出的精子，不能立即与卵子受精，必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力。1951年，张明觉和奥斯汀发现了这一生理现象，并把它称为“精子获能” （capacitation）。这一发现加速了科学家对精子获能机理的研究，并且找到了使精子在体外获能的物质，实现了各种哺乳动物精子在体外条件下的获能。

准备阶段2——卵子的准备

卵子一般在排出后2~3h才能被精子穿入。一些实验证据表明，卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程。动物排出的卵子成熟程度不同，有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等，有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等。但它们都要在输卵管内进一步成熟，当达到减数第二次分裂的中期时，才具备与精子受精的能力。

受精阶段

哺乳动物的受精过程主要包括：精子穿越放射冠和透明带，进人卵细胞膜，原核形成和融合。

获能后的精子与卵子相遇时，首先发生顶体反应，使顶体内的酶释放出来。放射冠是包围在卵子透明带外面的卵丘细胞群，精子所释放的顶体酶可直接溶解卵丘细胞之间的物质，形成精子穿越放射冠的通路。

穿过放射冠的精子立即与透明带接触，顶体酶随后将透明带溶出一条孔道，精子借自身运动穿越透明带，并接触卵细胞膜。在精子触及卵细胞膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应，这个反应称做透明带反应，它是防止多个精子进入透明带，引起多精子入卵受精的第一道屏障。

只有穿过透明带的精子才能与卵细胞膜接触。由于卵细胞膜表面有大量的微绒毛，当精子与卵细胞膜接触时，立即被微绒毛抱合，随后，精子外膜和卵细胞膜相互融合，精子入卵。

精子入卵后，卵细胞膜会立即发生一种生理反应，拒绝其他精子再进入卵内,这种生理反应称做卵细胞膜反应。这是防止多精入卵受精的第二道屏障。

精子入卵后的另一个变化，是尾部脱离，并且原有的核膜破裂；随后，精子形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子核还大的核，叫做雄原核。与此同时，精子入卵后被激活的卵子完成减数第二次分裂，排出第二极体后，形成雌原核，雌原核一般略小于雄原核。

雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此接触，二者体积缩小、合并，两组核染色体合为一组，形成一个含二倍染色体的合子，也就是受精卵。受精过程至此结束，受精卵的发育也由此开始。

胚胎发育

合子形成后即在输卵管内进行有丝分裂，开始发育。

胚胎发育的早期有一段时间是在透明带内进行的，这一时期称为卵裂（cleavage）期。其特点是：细胞分裂方式为有丝分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，或略有缩小。

根据胚胎形态的变化，可将早期发育的胚胎分为以下几个阶段。

桑椹胚 当胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹，叫做桑椹胚（morula）。实验证实，这一阶段前的每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞。

囊胚 桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。聚集在胚胎一端，个体较大的细胞，称为内细胞团（inner cell mass，ICM），将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的、个体较小的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。

随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部出现了含有液体的囊腔——囊胚腔，这个时期的胚胎叫做囊胚（blastula）。囊胚进一步扩大，会导致透明带的破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫做孵化（hatching）。

原肠胚 囊胚孵化后，再进一步发育，内细胞团表层的细胞形成外胚层，下方的细胞形成内胚层。这时的胚胎称为原肠胚（gastrula），由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。滋养层则发育为胎儿的胎膜和胎盘。

小知识

多数哺乳动物的第一极体不进行减数第二次分裂形成两个第二极体。

小知识

超数排卵处理的做法是给供体注射促性腺激素.使一头母畜一次排出比自然情况下多几倍到十几倍的卵子，用于体外受精和早期胚胎培养。

体外受精

哺乳动物的体外受精主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等几个主要步骤。

卵母细胞的采集和培养

对于实验动物如小鼠、兔，以及家畜猪、羊等，采用的主要方法是：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。

对于大家畜或大型动物，如牛，采用的主要方法是：从屠宰场已屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞，也可以借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等工具，直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。活体采卵在一些畜牧业发达的国家已开始商业化生产，它对充分发挥优良母畜的繁殖潜力具有重要意义.

精子的采集和获能

收集精子的方法有假阴道法、手握法和电刺激法等。

假阴道法是采用仿生学的方法，模仿发情雌性动物阴道环境设计的装置，它能够满足雄性动物交配时对压力、温度和润滑度的要求，同时配有与采精动物相适应的活台畜或假台畜（图3-12）。使用假台畜时，要训练被采精动物爬跨台畜，并将精液射入假阴道，以便收集。

在体外受精前，要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有培养法和化学诱导法两种：对于啮齿动物、家兔和猪等动物的精子，一般采用培养法，即将取自附睾的精子，放入人工配制的获能液中，培养一段时间后，精子就可获能；对于牛、羊等家畜的精子常采用化学法，即将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能。

受精

获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下都可以在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。

精子和卵子一般要放在培养液小滴内共同培养一段时间才能完成受精。

胚胎的早期培养

精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。哺乳动物胚胎的培养液成分一般都比较复杂，除一些无机盐和有机盐类外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养分，以及血清等物质。

当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植，或冷冻保存。

不同动物胚胎移植的时间不同，例如，牛、羊一般要培养到桑椹胚阶段或囊胚阶才进行移植，小鼠和家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎，即试管胚胎，可在8~16个细胞阶段移埴。

体外受精技术经过20多年的研究，已经取得很大进展，效率也不断提高，其中以牛的体外受精技术水平最髙。目前，从屠宰场废弃的卵巢中，每个卵巢平均可采集10枚可用的卵母细胞，经体外培养成熟和受精后，约可获得4枚可用的胚胎，移植给受体母牛最终可能产下1~2头犊牛。牛体外受精胚胎的工厂化生产已经成为可能。

胚胎工程的应用及前景

胚胎工程技术包含的内容很丰富，目前在生产中应用较多的是家畜的胚胎移植、胚胎分割和体外生产胚胎枝术。还有多项胚胎工程技术仍在深人研究或小规模试用。

胚胎移植

胚胎移植（embryo transfer）是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”（donor），接受胚胎的个体叫“受体”（recipient）。胚胎移植实际上是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程。在胚胎工程中通过任何一项技术，如转基因、核移植，或体外受精等技术获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。因此，胚胎移植又是胚胎工程其他技术的最后一道“工序”。

胚胎移植的现状和意义

近20年来，在胚胎移植中，牛的胚胎移植技术较为成熟。以奶牛为例，目前已达到一头供体牛平均每次处理收集到的胚胎，经移植可产下3~4头犊牛，由于每年可处理4~5次，这样，一头良种母牛一年生下的后代可达数十头，远远超过在自然状态下一生所得的后代数量。羊的胚胎移植效率比奶牛还要髙。

自20世纪60年代以来，我国家兔、绵羊、牛、马和山羊的胚胎移植相继获得成功。近10年来，牛、羊的胚胎移植在我国部分地区已进人生产应用阶段，这些成果大大推动了我国畜牧业的发展。

进行胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。在这项技术中，供体的主要职能变为只产生具有优良遗传特性的胚胎，繁重而漫长的妊娠和育仔的任务由受体取代，这就大大缩短了供体本身的繁殖周期。同时，在对供体施行超数排卵处理后，可获得多枚胚胎，经移植可得到多个后代，使供体生产下的后代数是自然繁殖的十几倍到几十倍。

胚胎移植的生理学基础

准备移植的胚胎，移植到任何一头母牛的子宫内都能发育吗？供体与受体之间进行胚胎移植时，会不会发生免疫排斥反应？要解决这些问题都需要对胚胎发育进行生理学方面的研究。

胚胎移植能否成功，与供体和受体的生理状况有关。

第一，哺乳动物发情排卵后，不管是否妊娠，在一段时间内，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的，这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。第二，哺乳动物的早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态，这就为胚胎的收集提供了可能。第三，大量的研究已经证明，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。第四，供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中不受任何影响。

胚胎移植的基本程序

以家畜的胚胎移植为例，胚胎移植主要包括对供、受体的选择和处理，配种或进行人工授精，对胚胎的收集、检查、培养或保存，对胚胎进行移植，以及移植后的检查等步骤。

与胚胎工程中的其他技术相比，胚胎移植已经是较为成熟的技术，但就目前发展的情况看，还需要进一步简化操作程序。

牛胚胎移植流程图

①对供，受体母牛进行选择，并用激素进行同期发情处理。

②用激素对供体母牛做超数排卵处理

③超数排卵的母牛发情后，选择同种优秀的公牛进行配种或人工授精。

④胚胎的收集：配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来（也叫冲卵）。

⑤冲卵后，对胚胎进行质量检查。这时的胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段。

⑥将收集的胚胎直接向受体移植或放人-196°C的液氮中保存。

⑦胚胎的移植：（1）手术法：引出受体子宫和卵巢，将胚胎注人子宫角，缝合

创口。（2）非手术法：将装有胚胎的移植管送入受体母牛子宫的相应部位，注人胚胎。

⑧对受体母牛进行是否妊娠的检查。

⑨受体母牛产下胚胎移植的犊牛。

在我国，牛和羊的胚胎移植技术已日臻完善和成熟，不久的将来，很有可能成为一项常规的繁殖技术。畜牧业发展和胚胎工程技术研究的不断深入，为胚胎移植的应用提供了广阔的平台。胚胎移植作为胚胎工程的最终技术环节，也将推动胚胎工程其他技术的研究和应用。

胚胎分割

能不能将一个胚胎分割成几份，从而提高胚胎的利用率呢？基于这样的设想，胚胎分割技术逐渐发展和成熟。

胚胎分割（embryo splitting）是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此，胚胎分割可以看做动物无性繁殖或克隆的方法之一。

近20年来，我国的胚胎工程专家也进行了胚胎分割移植的试验研究，相继成功地对小鼠、家兔、绵羊、山羊和牛等动物进行了分割胚胎移植，并将二分胚分割技术应用到牛和羊的胚胎移植中。

胚胎分割所需要的主要仪器设备为实体显微镜和显微操作仪。

进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后，用分割针或分割刀进行分割。对于不同发育阶段的胚胎，分割的具体操作不完全相同。

具体操作时，用分割针或分割刀片将胚胎切开，吸出其中的半个胚胎，注入预先准备好的空透明带中，或直接将裸半胚移植入受体。在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

尽管胚胎分割技术已在多种动物中取得成功，但仍存在一些问题，如刚出生的动物体重偏低，毛色和斑纹上还存在差异等。实践证明，采用胚胎分割技术产生同卵多胚的可能性是有限的，到目前为止，最常见的是经分割产生的同卵双胎，而同卵多胎成功的比例都很小。

胚胎干细胞

哺乳动物的胚胎干细胞（embryonic stem cell）简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。ES细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上，表现为体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，即可以分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，ES细胞可以增殖而不发生分化。对它可以进行冷冻保存，也可进行遗传改造。

ES细胞的分离和培养成功是胚胎工程中的重大成就之一，在基础生物学、畜牧学和医学上都具有十分重要的应用价值。

ES细胞可以用于治疗人类的某些顽症。人类由于细胞坏死、退化或功能异常引起的疾病，如帕金森综合征、少年糖尿病和老年痴呆症等，已成为医学上尚未攻克的顽症。利用ES细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。目前，在动物实验方面，用ES细胞诱导分化出的某些组织细胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑难病症。也许在不久的将来，当我们的身体某一类细胞功能出现异常或退化时，就可以通过诱导ES细胞定向分化来及时修补。

随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官，解决目前临床上存在的供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。

ES细胞也是研究体外细胞分化的理想材料。ES细胞在饲养层细胞上，或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。在培养液中加人分化诱导因子，如牛黄酸、丁酰环腺苷酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为掲示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段。

胚胎干细胞还可用于对哺乳动物个体发生和发育规律的研究。由于ES细胞可分化为胚胎的内胚层、中胚层和外胚层中任何一类细胞，于是可以将带有遗传标记的ES细胞注人早期胚胎的囊胚腔，通过组织化学染色，了解ES细胞的分化特点，这就为研究胚胎犮育过程中的细胞分化及组织和器官形成的规律，进而研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响的因素等提供了可能。

ES细胞的应用前景吸引着众多科学家投人到这一领域的研究中。目前，ES细胞的分离、培养体系的研究，以及ES细胞的选择、检测和全能性的维持，不仅是胚胎工程的前沿课题之一，也是当前生命科学研究的热门课题之一。

脚注：饲养层细胞一般为输卵管上皮细胞，在干细胞培养时，可作为提供干细胞分裂、增殖的营养细胞。

专题小结

哺乳动物在自然条件下，配子的发生、受精和早期胚胎的发育规律是胚胎工程的理论基础。体外受精和早期胚胎培养是人们模拟自然情况经反复探索得到的技术方法。

体外受精技术不仅可以为胚胎工程提供实验的原材料，也是胚胎工程关键的技木环节之一。胚胎移植在畜牧生产中已经显示出大幅度提高供体母畜繁殖力的作用，它又是胚胎工程技术的终端环节，即任何胚胎只有移植给受体才能获得后代。当前，胚胎工程研究的领域不断扩大，内容不断丰富，技术不断改进，效率也在逐步提高。经不同技术操作产生的具有不同遗传特性的胚胎，通过移植产生的后代，将不断向人们提供所需要的目的产品，为人类的生产、生活、医疗、卫生和健康服务。我们期待着更多的胚胎工程技术走出实验室，进入生产应用领域。